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牛副結(jié)核桿菌(MAP)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法） |
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牛副結(jié)核桿菌(MAP)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法）
【產(chǎn)品名稱】 通用名稱：牛副結(jié)核桿菌(MAP)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】 牛副結(jié)核病由副結(jié)核分枝桿菌引起的牛慢性增生性腸炎。呈世界性分布，中國也有發(fā)生。2～3歲的牛最易得病，表現(xiàn)為卡他性腸炎,長期頑固性腹瀉，極度消瘦。特征性病變?yōu)槟c粘膜高度增厚并形成皺襞，在皺襞褶中藏有大量成堆的抗酸性桿菌，但無結(jié)核或潰瘍。本試劑盒適用于檢測(cè)牛消化道組織，糞便或血液等樣本中的牛副結(jié)核桿菌，適用于牛副結(jié)核桿菌感染的輔助診斷。
【檢驗(yàn)原理】 本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)1對(duì)牛副結(jié)核桿菌特異性引物，結(jié)合1條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對(duì)牛副結(jié)核桿菌的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過5次，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】 ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】 病死或撲殺的牛，無菌剪取腸道等樣品1g；活畜取消化道淋巴組織樣本或糞便樣本進(jìn)行測(cè)試。
【保存和運(yùn)輸】 上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】 1. 樣品處理（樣本處理區(qū)） 1.1 樣本前處理 組織樣品：每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；分泌液和血液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。糞便樣本懸浮離心后取上清100ul于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 DNA提取 為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)） 根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
3. 加樣（樣本處理區(qū)） 將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)） 4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)； 4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL； 熒光通道選擇：檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM檢測(cè)牛副結(jié)核桿菌，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。 4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
5. 結(jié)果分析判定 5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定 設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷 陽性：檢測(cè)通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。 可疑：檢測(cè)通道35.0<Ct值<38.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無Ct值且無明顯的擴(kuò)增曲線。
6. 檢測(cè)方法的局限性 ? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)； ? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果； ? 陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果； ? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果； ? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果； ? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果； ? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線且無Ct值顯示； 陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
8. 性能指標(biāo) （1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%，綜合評(píng)價(jià)敏感性98%以上。最低檢測(cè)限不低于1000copies/ml。 （2）特異性：100%。 （3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%。
【注意事項(xiàng)】 ? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行； ? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心； ? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存； ? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊； ? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服； ? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染； ? 實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器； ? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。 從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色十余年，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴! 如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無法完成您的課題研究，歡迎您與我們聯(lián)系。
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