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2×GC-rich PCR MasterMix（無染料）說明書
貨號(hào)：K0658
保存條件：-20℃長期保存。如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復(fù)凍融。
組分說明
Cat. No. K0658
Kit Size 1 ml
2×GC-rich PCR MasterMix（無染料） 1 ml
RNase-Free Water 1 ml
注意：2×GC-rich PCR MasterMix含有Es Taq DNA Polymerase,
2×Es Taq PCR Buffer, 3 mM MgCl2和400 µM dNTP mix。
產(chǎn)品簡介
本品是由Es Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑
和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系，濃度為 2×。預(yù)配好的PCR混合液使操作更加2+ 簡單快捷，可最大限度地減少人為誤差和污染。經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液配方使酶的作用發(fā)揮最大功效，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜模板的高保真、高效率擴(kuò)增，d創(chuàng)的MasterMix配方使整個(gè)反應(yīng)體系非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。本品不含染料， PCR程序結(jié)束后可根據(jù)需要加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳操作。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3′端附有一個(gè)“A"堿基，因此可直接用于T/A克隆。主要適用于對(duì)保真性要求較高的PCR反應(yīng)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模板如GC含量高，有二級(jí)結(jié)構(gòu)等的擴(kuò)增，對(duì)簡單模板有效擴(kuò)增的片段可達(dá)20 kb，對(duì)復(fù)雜模板可達(dá)10 kb。
質(zhì)量控制
經(jīng)檢驗(yàn)無外源核酸酶活性； PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增多種基
因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個(gè)月，活性無明顯改變。
本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
使用方法
以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的
片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。
1. PCR反應(yīng)體系
試劑 50 μl反應(yīng)體系 終濃度
2×GC-rich PCR MasterMix 25 μl 1×
Forward Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Template DNA 2 μl <1 μg/reaction
RNase-Free Water up to 50 μl
注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2. PCR反應(yīng)條件
步驟 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 94℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 25-35個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 2 min
注意：1）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
2）延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，Es Taq DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/30 s。
3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
3.結(jié)果檢測：本產(chǎn)品不含染料，反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測結(jié)果。
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