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Protein A瓊脂糖凝膠說明書
Protein A-Agarose
Cat. No. K0011
保存：2-8℃
組分說明
Cat.No. K0011 K0011A
Volume 1 ml 5 ml
產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品可從血清，腹水，細胞培養(yǎng)上清和細胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物丌同亞型的抗體或包含抗體Fc 片段的基因工程重組蛋白。具有高IgG 結(jié)合特異性，高流速，低 Protein A-Agarose 脫落等特點。
注意事項
1. 凝膠從冷室或冰箱中取出后在室溫下緩慢振搖恢復(fù)到室溫， 裝柱，避免產(chǎn)生氣泡影響柱效。
2. 裝柱時盡可能維持凝膠長徑比為5：3-2：1，長徑比過大將導(dǎo)致洗脫峰拖尾，洗脫體積增大；長徑比過小將導(dǎo)致樣品不填料接觸時間短，吸附丌充分，填料吸附蛋白量小 。
3. 若上樣液中抗體濃度過高應(yīng)使用平衡緩沖液稀釋至 1-2mg/ml，以免上樣濃度過高影響柱效。
4. 可以采用降低上樣時的流速來增加樣品不填料接觸時間從而提高純化抗體量。
5. 凝膠用低pH緩沖液洗脫時間應(yīng)盡可能短，洗脫后用中性緩沖液盡快中和至 pH中性，以延長親和介質(zhì)的使用壽命。
6. 洗脫后，應(yīng)立刻用如中和緩沖液將收集到的抗體溶液中和到中性（pH7.4 左右），以利于維持抗體的生物活性，避免抗 體失活。
7. 填料使用后應(yīng)用 0.1M 檸檬酸鈉緩沖液（pH3.0）做再生處理，長期采用的洗脫條件將縮短親和介質(zhì)的使用壽命。
8. 其它柱再生處理方法：本產(chǎn)品使用10 次以上后先用20%乙醇洗 5 個柱床體積，再用 70%乙醇洗脫5-10 個柱床體積，可洗脫脂類和疏水性較強的蛋白質(zhì)，避免使親和介質(zhì)的載量下降、干擾親和介質(zhì)的應(yīng)用效果。
操作步驟
I 緩沖液的準備
1. 平衡緩沖液：純化不同動物和不同亞型抗體時所用平衡緩沖液是丌同的，部分參照如下
抗體 平衡緩沖液成分人 IgG1、人 IgG2、小鼠 IgG2a、小鼠 IgG2b 20 mM 磷酸鹽緩沖液，300 mM NaCl，pH 7.4-8.5
人 IgG3、人 IgG4、小鼠 IgG1、大鼠 IgG3 50 mM Tris-Cl，3M NaCl，pH7.8-8.5
2. 洗脫緩沖液：0.1M 檸檬酸鈉緩沖液，pH4.0。
3. 再生緩沖液：1M NaCl。
4. 中和緩沖液：1M Tris-Cl，pH9.0。
注意：
1）對于某些純化載量較少的抗體，可適當提高需平衡緩沖液中的鹽濃度 （zui高可達3M）和pH 值 （zui高可達8.2），以提高抗體和介質(zhì)的吸附力。但是有時高pH會使雜蛋白吸附增加，使用者應(yīng)根據(jù)實際使用狀況適當調(diào)節(jié)。
2）以上緩沖液使用前均需0.45μm濾膜過濾。
II 樣品的準備
1. 樣品用平衡緩沖液稀釋5-10倍，以保證樣品液的成分及pH和平衡緩沖液接近。若上樣體積過大，可以采取調(diào)節(jié)上樣液pH和鹽濃度的方式，使樣品的pH和電導(dǎo)不平衡液接近，并使樣品中的緩沖體系不平衡緩沖液相同。
2. 細胞培養(yǎng)液中大量的血清蛋白會對親和層析造成一定的干擾，去血清處理或稀釋樣品將提高純化抗體收率。
注意：樣品在上柱前需0.45μm微孔濾膜過濾。
III 操作步驟
1. 填料裝柱后，用超純水流洗3-5個柱床體積以洗掉乙醇，用平衡緩沖液流洗5-10個柱床體積平衡柱子。
2. 將樣品上柱，上樣流速60cm/h。
3. 平衡緩沖液再洗5-10個柱床體積，直至基線平穩(wěn)。
4. 洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，用中和緩沖液將洗脫收集樣品中和到中性。
5. 立即用5-10個柱床體積平衡緩沖液平衡柱子到中性。
6. 再生緩沖液流洗3-5個柱床體積。先后用純水、20%乙醇分別流洗 3-5 個柱床體積。柱子置于4~8℃保存。
注意：操作中如果沒有實時的蛋白監(jiān)測系統(tǒng)，收集洗脫峰時可以分階段收集到多個管中，后根據(jù)測定結(jié)果重新調(diào)整收集方式。
